*CRISPR-Cas9 er en eksperimentell genredigeringsteknikk som brukes for å gjøre presise endringer i DNA. For første gang har forskere brukt denne teknikken for å angripe Huntington-mutasjonen i hjernecellene hos mus. Andre forskere forbedrer CRISPR-Cas9 for å gjøre den mer effektiv, spesifikk og trygg. Den er fortsatt langt fra å kunne brukes på HS-pasienter, men bruken på mus er et spennende skritt framover.

Genredigering med CRISPR-Cas9

DNA er den grunnleggende koden som styrer vekst og funksjon av levende celler. Vår evne til å manipulere denne koden, - en gang tema i science fiction, har fått igang forskning på arvelige sykdommer som Huntingtons sykdom. Design og bruk av verktøy for å forandre DNA er kjent som genredigering, og et verktøy som har fått oppmerksomhet nylig kalles CRISPR-Cas9. Siden det ble introdusert, har HS-forskere undersøkt muligheten for at CRISPR-Cas9 kan brukes til å redigere bort den genetiske mutasjonen som forårsaker HS.

Denne eksperimentelle teknikken er ennå ikke klar for å brukes på mennesker, men den har beveget seg raskt fra reagensrør til levende celler til organismer. Nye arbeider fra flere forskningsgrupper har vist at CRISPR-Cas9 kan brukes til å redigere HS-genet i hjernen hos levende mus. Enda mer spennende er det at et av laboratorienes siste funn viser forbedret atferd hos HS-mus etter at CRISPR-Cas9 ble tilført hjernen. Denne genredigerings-teknologien fortsetter å bli mer sofistikert, og flere HS-forskningsteam prøver den ut på utfordringene for HS-terapi. La oss snakke om hvordan CRISPR-Cas9 virker, bruken av det i tilknytning til HS og hvorfor man bekymrer seg for tryggheten på dette stadiet.

HS-genet: Å redigere fortellingen

HS er forårsaket av et uønsket tillegg til den genetiske koden. Milliarder av biologiske byggeklosser, nukleotidene C,G, A og T, finnes i den fulle DNA-koden. Disse nukleotidene blir lest og tolket bit for bit - seksjoner av genet som kalles exoner. Du kan tenke på et nukleotid som en bokstav,tre nukleotider som et ord, et exon som en setning, genet som et avsnitt og hele genomet som en instruksjonsbok som beskriver alle de nødvendige delene som behøves for at en celle skal vokse og fungere.

La oss zoome inn på et avsnitt av fortellingen, genet som forårsaker HS. Hos mennesker som vil utvikle HS, inneholder den første setningen en feil: En rekke med C-A-G-bokstaver som gjentas… og gjentas og gjentas og gjentas og gjentas og gjentas… mange flere ganger enn nødvendig. Hva om vi kunne redigere CAG-repetisjonsfeilen, som å slette alle de ekstra gjentakelsene fra setningen? Dette er hovedfokuset for genredigering innenfor HS-forskning, og CRISPR-Cas9 er en av flere tilnærmingsmåter.

CRISPR-Cas9: Å foreta kuttet

Det finnes ikke noe som svarer til et tekstbehandlingsprogram for å redigere gener. For å reparere gener i mikroskopisk skala, celle for celle, må koden med feil lokaliseres og fysisk kuttes - og det er hva CRISPR-Cas9 gjør. Denne kuttingen krever to komponenter: (1) En guide RNA og (2) et klippe-enzym kalt Cas9. Her er en en enkel analogi: Tenk deg at du vil klippe et stykke av et bånd, men vennen din har saksa. Du kan holde båndet med to hender, og holde båndet stramt for å vise vennen din hvor han skal klippe. Slik fungerer CRISPR-Cas9, i mikroskopisk skala: RNA-guiden finner og presenterer det riktige stedet på DNAet, og Cas9 er saksa, og klipper opp DNAet.

I laboratoriet kan forskere designe spesifikke RNA-guider som vil vise Cas9 hvor det skal klippes, en gang på hver side av det ekstra lange rekken med C-A-G repetisjoner i HS-genet. Da kan de to endene bli skjøtet sammen, og den skadelige delen er fjernet permanent. Slik bruker forskere CRISPR-Cas9 for å redigere genetiske sekvenser.

Som en analogi, tenk deg at du skrev en melding til en venn ved middagsbordet hvor det sto: “Vær så snill å send meg smøret”. Hvis du uforvarende hoppet over et par bokstaver - f.eks. “ær” - men beholdt strukturen på meldingen, ville din venn mottatt: “Vså sn illås e ndme gsm øretxx”. Når genetiske meldinger blir rotet til med små delesjoner som dette, har cellene mekanismer som gjenkjenner feilene og ignorerer innholdet deres. Dette gir forskerne en måte å benytte CRISPR-Cas9 for effektivt å slette et gen, heller enn å redigere sekvensen på en mer spesifikk måte.

CRISPR-Cas9 i hjernen hos HS-mus

Et par forskningsgrupper har nettopp oppdaget at det er mulig å redigere HS-genet i hjernen hos levende mus. Et team som arbeider ved Emory-universitetet i USA, ledet av Xiao-Jiang Li,fant nettopp ut at å lage små kutt i HS-genet kunne ha fordelaktige effekter på HS-mus. I disse eksperimentene brukte de CRISPR-Cas9 i en modus for sletting, istedenfor redigering som kan erstatte det lange C-A-G'et med et kort et.

For å bruke CRISPR-Cas9 i en HS-mus, må RNA-guiden og “Cas9-saksen” transporteres av spesielt designede virus som må injiseres i hjernen. Lis gruppe benyttet denne teknikken for å komme til striatum, et område i hjernen som kontrollerer stemning og bevegelse, og som blir skadet i sykdomsforløpet. Noen få uker senere hadde CRISPR-Cas9 spredt seg til mange celler, hvor det hemmer det dysfunksjonelle HS-genet, og tegn på stress på nervecellene har avtatt.

Etter tre måneder var det færre skadelige klumper av huntingtin-protein i hjernecellene, og på bevegelsestester hadde HS-musene forbedret seg noe. Det mest spennende aspektet ved dette eksperimentet var tilfriskningen hos eldre mus som alt hadde utviklet symptomer. Til og med ni måneder gamle mus (middelaldrende) ble bedre etter å ha fått injeksjonene, noe so tyder på at hjernene deres delvis kan leges etter et halvt liv med skade.

Å gå videre med forsiktighet

De fleste mennesker med HS har kun en kopi av de muterte genet og en annen kopi som er fullstendig frisk. Det er en viss bekymring ved å bruke CRISPR-Cas9 som terapi, fordi det ved siden av å fjerne den skadete delen av HS-genet, også permanent kan fjerne en del av den friske kopien. Li-laboratoriet gjorde også noen eksperimenter for å se på dette spørsmålet ved å arbeide med mus som hadde to HS-gen-kopier med feil, og brukte CRISPR-Cas9 for å fjerne begge. Det var ingen umiddelbar fare for musene, men de ble bare observert i noen få uker.

Sikkerheten med hensyn til å forstyrre den normale kopien av HS-genet er viktig når det gjelder den pågående kliniske studien med en huntingtin-senkende ASO. Legemidlet reduserer nivået av både den muterte og den friske kopien av HS-genet. Noe av forskningen på mus har vist at dette er ufarlig sent i livet, men at det er vanskelig å være sikker, fordi livslengden til en mus er så mye kortere enn hos et menneske. Firmaene som gjennomfører ASO-studien - Roche og Ionis - er svært klar over disse faremomentene, og overvåker forsøkspersonene nøye med tanke på hvilke som helst tegn på problemer forårsaket av å hemme HS-genet.

«Det mest spennende aspektet ved dette eksperimentet var tilfriskningen hos eldre mus som allerede hadde utviklet symptomer. »

Det er andre vesentlige forskjeller mellom ASO-medikamenter og tilnærmingen ved CRISPR-Cas9. ASO-forsøket som pågår på mennesker er en huntingtin-senkende eller gen-inaktiverende terapi, som virker ved å hemme begge kopier av HS-genet. Dersom behandlingen stopper, vil genet gjenvinne sin funksjon. Derimot vil genredigering med CRISPR-Cas9 skape en permanent forandring i DNA, og må derfor møtes med enda større forsiktighet. Det finnes bevis for at HS-genet, skadet eller ikke, har viktige funksjoner i cellen, og vi vil ikke risikere varige bieffekter. De gode nyhetene er at HS-forskerne takler utfordringen med å unngå den friske kopien av genet, kjent som en allel-spesifikk tilnærming.

Forbedring av teknikken for genredigering

To grupper har nylig forbedret CRISPR-Cas9-teknikken ved å bruke den til å klippe og inaktivere kun den skadete kopien av genet. Et team ledet av Jong-Min Lee ved Massachusetts General Hospital, fikk til en allel-spesifikk fjerning ved å bruke smart designede RNA-guider. Guidene fant fram til små forskjeller i DNA-bokstavene nært inntil HS-mutasjonen, og rettet inn to Cas9 kutt. Tilnærmingen deres er ny ettersom genredigeringen nå kan bli “personlig” avhengig av et individs DNA.

Den andre gruppen, ledet av Beverly Davidson ved Children’s Hospital of Philadelphia, benyttet en tilsvarende tilnærming for å sikte mot kun det muterte genet, og gjøre mindre kutt med Cas9. Dette stoppet produksjonen av mye skadelig huntingtin-protein. Som Lis gruppe, kunne de også inaktivere HS-genet i hjernen til levende mus. Om en av de nye CRISPR-teknikkene vil forbedre atferden til HS-mus gjenstår å se, men begge innovasjonene er et skritt mot framtidens genterapi.

Utfordringer med genredigering

Vi er svært spente på bruken av genredigering for å forstå HS bedre. Bruken av CRISPR i levende mus og utviklingen av allel-spesifikke tilnærminger representerer et tydelig skritt framover, men det er flere hindre å forsere før CRISPR-Cas9 kan utvikles til en behandling for HS. Her er hovedutfordringene som forskerne står overfor, og vår nåværende kunnskapssituasjon:

1. Presisjon: Bli sikker på at Cas9 kun kutter i det genet det er designet for å kutte, og ikke lager tilfeldige skader andre steder. Forskere ser ut til å være på god vei til å sikre at CRISPR blir svært spesifikk.

2. Allel-spesifisitet: Sikre at kun den muterte kopien av HS-genet, og ikke den friske, blir fjernet. Forskningen vi har beskrevet her er et spennende skritt framover.

3. Levering: Å få CRISPR-Cas9-maskineriet inn i mange nerveceller i hjernen og fjerne HS-genet fra hver og en. Nå vet vi at det er mulig i mus, men det gjenstår et stort hinder uansett hvilken behandling som skal benyttes i hjernen hos mennesker.

4. Kortsiktig trygghet: Å sikre at det å fjerne en del av HS-genet ikke vil gi umiddelbare nevrologiske problem eller til og med død. Så langt ser det bra ut.

5. Langsiktig trygghet: Å sikre at det å redigere HS-genet vil være trygt over en lang tidsperiode. Dette er et svært vanskelig spørsmål å få svar på ved å forske på mus. Vi kan kanskje få svar gjennom forsøk på primater, eller fra mindre permanente teknikker i kliniske forsøk.

Den huntingtin-senkende ASO-studien er fortsatt i tidlig fase av trygghetstesting, men tilnærmingen har vært lovende så langt. Genredigering kan introdusere varige forandringer på det som er skrevet inn i DNA-koden, med dyptgripende konsekvenser. Å bruke CRISPR-Cas9 trygt, blir eksponensielt mer utfordrende jo nærmere klinikken det kommer. Uansett, neste generasjon av denne teknologien er utrolig løfterik, og mange hjerner beveger den framover på innovative måter.